2 - تهیه لام های دفن شده در خاک
آشنایی با روش نمونه برداری، نگهداری و تهیه لام از خاک
میکرو بیولوژی و شیمی خاک حایز اهمیت می باشند که بر اساس اصول صحیح جمع آوری و نگهداری کرده و آزمایش مورد نظر را انجام می دهیم نکته مهم اینکه خاک از جمله محیطهایی است که حتی در یک محدوده معین ویژگیها و شرایط آن از نظر فیزیکی- بیولوژیک و شیمیایی با همدیگر فرق دارند. مثلاً در یک محدوده خاص مثل بلندی تپه در مقایسه با ارتفاع کم ویژگیهای متفاوت می باشد و حتی در یک باغچه که به آن کود داده می شود جاهایی که کود بیشتری دریافت کرده و یا کمتری دریافت کرده شرایط متفاوتی دارد، بنابراین تهیه این نمونه ها یا به منظور انجام آزمایشهایی میکرولوژی انجام می شود و یا آزمایشهای شیمیایی که این دو تفاوتی کوچک از نظر جمع اوری و نگهداری دارند. برای نمونه برداری و جمع آوری از دستگاههای نمونه بردار خاصی آگلر استفاده می شود که غالباً نوعی لوله نمونه برداری است که طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزی می باشد و ویژگی که دارند روی سطح آنها مدرج شده است که به منظور اندازه گیری از عمق مورد استفاده قرار می گیرد که به شکل عمودی بر روی نقطه ای که برای برداشت نمونه مشخص شده است قرار گرفته است و با فشار دادن دست یا فشارمکانیکی در خالک فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاک پر می شوند و بعد محتویات آنها با یک ظرف ترجیحاً استریل یا یک کیسه پلاستیکی منتقل می شوند.
مرحله دوم نگهداری نمونه ها می باشد که اگر مجبور به نگهداری شویم بایستی نمونه های جمع آوری شده در شرایطی که از نظر دما و رطوبت تشابه زیادی با زمان برداشت نمونه دارند نگهداری شوند که مثلاً در مورد نمونه های میکروبی دمای مشابه دمای برداشت نمونه مناسب بوده که فعالیت میکرو ارگانسیم ها را کند می کند در مورد آزمایشهای شیمیایی روشهایی مانند منجمد کردن و خشک کردن برای نگهداری مورد نظر می باشد .
مرحله انجام آزمایش:
برای شروع کار ابتدا یک نقطه مناسب را برای برداشت نمونه در نظر می گیریم و در مرحله اول باید یک برچسب تهیه کرده و مشخصات دقیق محل برداشت نمونه را روی آن برچسب می نویسیم یعنی اینکه اگر برای برداشت مجدد نیاز باشد بایستی بتوانیم نمونه برداری را عیناً تکرار کنیم که بتدریج فناوریهای جدید مثل GPS نیز مورد استفاده قرار می گیرد در درجه دوم مشخصات ظاهری خاک را بایستی یادداشت کنیم که شامل: نوع دانه بندی خاک- پستی و یا بلندی - خشکی و دیگر مشخصات و بعد از مدتی که مراجعه کردیم متوجه تغییرات آن شویم معمولاً این برچسبها حاوی تاریخ، شرایط اقلیمی، نام نمونه بردار و هر اطلاعات دیگری که لازم بوده و به تفسیر نتایج آزمایش کمک کند می باشد.
انجام آزمایش:
پس از تحویل گرفتن وسایل مورد نیاز شامل یک کیسه نایلون تمیز و دماسنج و تیغه محل نمونه برداری پشت آزمایشگاه کنار درخت بزرگ زبان گنجشک و قسمت شمال غربی آن تعیین گردید و ضمن مراجعه در محل با استفاده از لوله مخصوص که برای نمونه برداری پیش بینی شده بود با فشار مکانیکی در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداری و تخلیه آن داخلا یک پلاستیکی گردید البته قبلاً با استفاده از دما سنج مخصوص و با فرو کردن آن در داخل و ایست چند دقیقه ای درجه حرارت خاک تعیین گردید سپس درجه حرارت هوا نیز اندازه گیری و بود. پس از ثبت مشخصات شامل 1- نام نمونه بردار: علی اکبر نوروزی 2- ساعت 15/15 روز دوشنبه 3/12/84 3- مکان: آموزشکده محیط زیست پشت آزمایشگاه میکرولوژی جنب درخت بزرگ زبان گنجشک و قسمت شمالی آن 4- درجه حرارت هوا 5- درجه حرارت خاک 6- شرایط اقلیمی : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگی متناوب
در مرحله بعد از تحویل گرفتن یک عدد بوکال ( وسیله قراردادن خاک و لام ها و تماس آنها با همدیگر به منظور ایجاد تماس مناسب محیط کشت با خاک) و 6 عدد لام یا اسلاید که با استفاده از میکروفیلم آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذیری آن را تضمین می کنیم که یک طرف آنها را با سواپ که قبلاً با استفاده از محیط کشت نوترینت براث (NB) آغشته می کنیم ( در شرایط استریل)
پس از آماده کردن سه عدد اسلاید دو طرفه که یک طرف آن آغشته به محیط کشت NB می باشد آنها را با فاصله در داخل بوکال قرار می دهیم و سپس با استفاده از قاشقک میان آنها را با آرامی با خاک پر می نماییم و درب بوکال را بسته و در دمای گرما گذاری می کنیم که اگر شرایط دمای اطاق این باشد مطلوب است در غیر اینصورت آن را داخل انکوباتور به مدت دو هفته قرار می دهیم تا میکروارگانیم ها روی آن رشد کند.
عنوان آزمایش: الف) شمارش باکتریهای هتروتروف هوازی خاک به روش plate
count
هدف: آشنایی با روش کلاسیک شمارش باکتریهای زنده
تاریخ: 10/12/84
انجام آزمایش:
باکتریها غالبترین جمعیت میکروارگانیم های خاک را تشکیل می دهند و در خاکهای معمولی بین عدد در هر گرم خاک موجود می باشند در خاکهای فاضلاب و لجن فعال یا کشاورزی یا کود دهی بالا با میکروبی بالایی دارند.
استفاده از رفتهای متوالی و کشت در پلیت به روش pour plate می باشد خاک بدلیل اینکه دارای باکتریهای زیادی می باشد قابل کشت بصورت مستقیم نمی باشد لذا ابتدا سوسپانیون را تهیه و با استفاده از مایع مناسب که آسیبی به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن می کنیم و با استفاده از روشهای مکانیکی آن را به هم می زنیم یا با استفاده از دستگاهی بنام shaker که با دور مشخص ( مثلاً 2000RPM یادویست دور در دقیقه ) به مدت ده دقیقه که سلولها به هم چسبیده جدا و معلق شوند البته این روش علاوه بر خاک در مواد غذایی نیز مورد استفاده دارد . روش مناسب دقیق سازی تهیه وقتهای متوالی است که مایع مناسب برای آن سرم فیزیولوژیک یا آب مقطر می باشد.
میزان جهش زایی مولکلوهای زیستی در ذرات معلق موجود در آلودگی هوا، در بسیاری از شهرها، از جمله شهر بورتو واقع در کشور برزیل، بررسی شده است. این مطالعات معمولاً توسط روش سالمونتلا/ میکروزوم صورت می گیرد. ذرات متعلق هوا جمع آوری شده، و جداسازی می شوند، سپس جهش زایی در هر بخش بررسی میشود. این کمیت توسط بررسی میزان جهش های ایجاد شده در سوشهای سانلمونلا تیفی موریم[1] TA98-NR , TA98 و TA98/1,8 DNP به دست می آید. جهش هایی شامل تغییر چارچوب خواندن در ژن ها توسط ترکیبات آلی حل شونده در سیکلوهگزان غیرقطبی و دی کلرومتان نیمه قطبی، شناسایی شدند. مقدار این جهشها در مواقع مختلف سال متفاوت و در اماکنی که بیشتر در معرض دود اتومبیل ها میباشند، بیشتر می باشد. به عنوان مثال، دی کلرومتان (DCM) در هنگام بهار و سیکلوهگزان (CX) در تابستان بیشترین تاثیر جهش زایی خود را بروز می دهند. بدون شک رابطه ای بین میزان آلودگی هوا و جهش زایی وجود دارد و روش سالمونتلا/ میکروزوم، متد بسیار مناسبی برای تعیین میزان آلایندگی یک محیط درتولید جهش ها می باشد.
مقدمهآلودگی ذرات معلق، یکی از مهم ترین عوامل آلودگی محیطی است که تاثیر بسزایی بر روی کیفیت زندگی تمامی موجودات زنده می گذارد. سازمان جهانی بهداشت آلودگی هوا را از تاثیرگذارترین فاکتورها در بیماری هایی مانند عفونتهای تنفسی، سرطان و بیماری های قلبی می داند.
یکی از کمیتهایی که آلودگی محیطی را نشان می دهد، مقدار کل ذرات معلق موجود در جو می باشد. مقدارهای مجاز، خطرناک و زیاد ذرات معلق، در استانداردهای جهانی، به طور کامل تعیین شده اند. علاوه بر این، مشاهدات جدید نشان می دهند که مولکولهای آلی متصل به ذرات معلق، قابلیت جهش زایی بالایی دارند و معمولاً تحت گروه مولکولهای سرطان زا طبقه بندی می شوند. متد سالمونلا/ میکروزوم، تعیین و شناسایی این مولکول ها را برای ما مقدور ساخته است که مهمترین آنها پلی سیکلیک هیدروکربن های آروماتیک (PAH) و مشتقات آنها میباشند. این مولکولهای آلی، غالباً از سوخت ناقص سوختهای فسیلی در فرایندهای صنعتی حاصل می شوند و جهش زایی آنها به مراتب در مطالعات مختلف اثبات شده است.
در این نوشته، به مطالعه متد سالمونلا/ میکروزوم و به کارگیری آن بر روی نمونههای مختلفی از ذرات معلق موجود در هوا می پردازیم. در یک آزمایش، برای مطالعه نمونه های به دست آمده از چهار ناحیه ای شهری، چه در بهار و چه در تابستان، از این متد استفاده شده است. روش سالمونلا/ میکروزوم را می توان به طور غیرمستقیم، برای تعیین میزان ذرات معلق در هوا به کار برد و تاثیرات آن را بر محیط و همچنین سلامت انسان مورد بررسی قرار داد.
لوازم و روشها- نمونه: ذرات معلق موجود در هوا، در چهار ناحیه از شهر “پورتو” در جنوب برزیل در تابستان (ماههای دسامبر و فوریه) و در بهار (ماه اکتبر) با دمای متوسط به ترتیب 24 و 19 به دست آمده اند.
چهار منطقه مورد استفاده دارای مشخصات زیر می باشند.
1- ناحیه اول: در یک ناحیه دارای مترو، با فاصله km1 از خیابان اصلی با ترافیک عادی (سه هزار وسیله نقلیه بر ساعت)، به دور از مناطق صنعتی و در کنار فضای سبز.
2- ناحیه دوم: یک منطقه نیمی صنعتی، نیمی مسکونی، با صنایع کوچک و متوسط، با ترافیک 600 وسیله نقلیه در ساعت و به فاصله 2 کیلومتر از یک بزرگراه.
3- ناحیه سوم: منطقه ای با ترافیک سنگین، حدود 7400 وسیله بر ساعت در یک تقاطع مهم، واقع در پایین شهر.
4- ناحیه چهارم: یک تقاطع با ترافیک سنگین (6400 وسیله در ساعت) در کنار ایستگاه اتوبوسها و وسائط نقلیه عمومی.
نمونه های ذرات معلق، جمع شده بر روی فیلترهای شیشهای، توسط سمپلرهای با حجم بالا جمع آوری می شوند. فیلترها، قبل و بعد از آزمایش مورد اندازه گیری وزن قرار گرفته و بدینوسیله میزان ذرات معلق هوا محاسبه می شود. مقدار ذرات معلق با کمیتی با نام TSP معرفی می شود. مقدار هوای عبور داده شده از فیلترها در حدود 1769 تا 2383 مترمکعب بوده و بین 32 تا 385 میلی گرم ذرات معلق به دست آمدهاند که غلظتی حدود 17 تا 161 میکروگرم بر مترمکعب را نشان می دهد (در جدول 1 در انتهای این فصل، اطلاعات مربوط به نمونه ها به طور کامل آورده شده است).